绿色荧光蛋白
定义
绿色荧光蛋白是一类由生物体自身基因编码、无需底物即可发出荧光的蛋白质，其名称来自它在受到紫外光或蓝光激发后发射的绿光[1]。研究最充分的成员来自维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)，由 238 个氨基酸残基组成，分子量约 27 千道尔顿[4]。类似的绿色荧光蛋白还见于海肾(Renilla reniformis)等海洋生物[5]。
在化学性质上，这类蛋白相当稳定，难以被普通条件变性，其荧光性质在较宽的 pH 范围内也基本保持[4]。它的价值在于荧光完全由蛋白质自身的氨基酸序列决定，只要导入相应基因，细胞就能自行合成并发出可见光[6]。
原理
从结构上看，绿色荧光蛋白的多肽骨架折叠成由 11 股反平行 β 折叠围成的桶状结构，中央的 α 螺旋中包裹着发光基团，整体形似一个装有色素的桶[7]。桶状外壳把发光基团与外界隔开，起到保护作用，因此荧光不易受周围环境干扰[8]。
发光基团由第 65 至 67 位的丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸三个残基经环化、脱水与氧化反应自发形成，这一成熟过程需要分子氧参与[8]。野生型蛋白的吸收光谱有两个峰，主峰约在 395 纳米，次峰约在 475 纳米，发射峰约在 509 纳米。激发后，中性酚式基团可通过分子内的激发态质子转移转变为酚氧负离子形式，从而发出绿光。
这种发光属于荧光而非化学反应发光：蛋白吸收较短波长的光，再把其中一部分能量以较长波长重新发射，不需要荧光素或荧光素酶参与[9]。把两个荧光蛋白分别作为供体与受体、在距离足够近时即可发生共振能量转移，这一效应被用来构建感受器，信号强弱近似随间距的六次方变化，因而对纳米尺度的构象变化十分敏感[6]。
发展历程
1961 年起，旅美日本生物化学家下村修与美国生物学家弗兰克·约翰逊开始追查水母发光的原因，1962 年发表论文，报道在水母中发现了水母素与另一种发绿光的蛋白[10]。他们观察到这种蛋白在阳光下呈绿色、钨丝灯下呈黄色、紫外光下呈强烈绿色，确认其发光不依赖荧光素类底物[11]。
此后研究的关键一步来自基因层面：1985 年与 1992 年，道格拉斯·普瑞舍先后获得了水母素与绿色荧光蛋白的 DNA 序列，使研究者能够直接操作编码序列而非纯化蛋白[11]。1994 年，马丁·查尔菲等把该基因导入大肠杆菌和秀丽隐杆线虫，使活体细胞的特定细胞发出荧光，表明它可以作为通用的生物标记[12]。
1994 年起，钱永健开始对绿色荧光蛋白做定点突变改造。1995 年报道的 S65T 单点突变消除了紫外区激发峰，把主激发峰移至 488 纳米，显著提高了荧光亮度与光稳定性；叠加 F64L 突变后得到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)，成为使用最广的变体。同一时期还发展出黄色、蓝色等不同颜色的变体，2006 年又报道了可高效折叠的超级折叠绿色荧光蛋白。2008 年 10 月 8 日，瑞典皇家科学院把当年诺贝尔化学奖授予下村修、查尔菲与钱永健，三人平分 1000 万瑞典克朗奖金[13]。
应用
最常见的用途是作为报告基因与蛋白标签。把绿色荧光蛋白的编码序列与目标基因拼接，细胞内合成的融合蛋白会带上荧光，研究人员便可在荧光显微镜下判断基因何时、何地表达，以及蛋白在细胞内的定位与迁移[14]。同类方法也被用于追踪病原菌侵入活细胞的过程、观察肿瘤的发生与生长，以及构建转基因动物[14]。
在此基础上发展出基因编码的荧光感受器。1997 年宫脇等人把青色与黄色荧光蛋白分别接在钙调蛋白和其结合肽两端，构建出名为 Cameleon 的钙指示剂：钙离子结合后两个荧光蛋白靠近，能量转移增强，黄色发射上升而青色发射下降，二者的比值可换算为钙浓度[6]。此后又出现了基于单个环形排列荧光蛋白的 GCaMP 系列等指示剂，用于记录神经元活动与细胞内信号动态[15]。
多色变体还支持同时观察多种对象。2007 年报道的 Brainbow 技术在小鼠发育中的神经元内随机组合表达三种以上荧光蛋白，使相邻神经元的颜色各不相同，从而在密集的脑组织中区分并追踪单个细胞[9]。
局限
荧光基团的成熟依赖分子氧，因此在缺氧环境中绿色荧光蛋白可能无法正常发光，这限制了它在厌氧微生物研究和肿瘤缺氧区域成像中的使用[16]。荧光对酸性环境也较敏感，在酸性细胞器中信号会明显减弱[17]。
蛋白体积较大，约 240 个氨基酸、28 千道尔顿，与目标蛋白融合时可能造成空间位阻，遮挡催化位点或干扰其正常折叠与定位，因此需要在融合位置和连接序列上反复调试[18]。天然绿色荧光蛋白还有形成弱二聚体的倾向，可能导致融合蛋白错误定位或聚集，通常需引入 A206K 等突变使其保持单体状态[17]。
在成像性能上，它也存在客观限制：持续激发会导致光漂白，单分子水平上还会出现荧光明暗闪烁，使定量测量变得复杂[19]。此外，荧光蛋白只能在基因层面与目标蛋白相连，无法标记脂类、小分子等非蛋白成分，对这类对象需改用其他探针[18]。
参见
参考资料
- 图文详情——科普中国资源服务 [引用日期2026-10-29]
- CAS IR GRID [引用日期2026-10-29]
- 钱永健等三位科学家赢得诺贝尔化学奖 [引用日期2026-10-29]
- 332 细 胞 生 物 学 杂 志 2002年 [引用日期2026-10-29]
- 绿色荧光蛋白及其应用 [引用日期2026-10-29]
- abstract03(PDF) [引用日期2026-10-29]
- google.com 上的网页 [引用日期2026-10-29]
- 绿色荧光蛋白发光原理 （发色团） [引用日期2026-10-29]
- Green Fluorescent Protein - Chapters and Articles [引用日期2026-10-29]
- 2008年诺贝尔化学奖得主下村修将到北大讲学-北京大学新闻网 [引用日期2026-10-29]
- 诺贝尔化学奖解读 “绿色荧光蛋白”让未知世界显影 [引用日期2026-10-29]
- 钱永健：为生物科学点亮一盏明灯 [引用日期2026-10-29]
- 日美科学家分享2008年诺贝尔化学奖 [引用日期2026-10-29]
- 中国实验诊断学 [引用日期2026-10-29]
- ijms-22-08930(PDF) [引用日期2026-10-29]
- We narrowed to 2 results for: avGFP [引用日期2026-10-29]
- 荧光蛋白简介 [引用日期2026-10-29]
- addgene.org 上的网页 [引用日期2026-10-29]
- xml [引用日期2026-10-29]