fitc

定义

fitc指的是荧光素异硫氰酸酯，化学式写作 C21H11NO5S，分子量约 389.38。^[3] 它由荧光素骨架和异硫氰酸酯基团（-N=C=S）构成，属于荧光素的一类衍生物，商品中常以 5-异硫氰酸荧光素与 6-异硫氰酸荧光素两种异构体的混合物形式出现。^[4] 作为标记试剂，它本身不针对特定生物靶点，作用在于把荧光基团连接到目标分子上，从而让该分子可被光学仪器检出。^[1]

两种常见异构体的编号不同，其中异构体 I 通常在标记效率与稳定性方面表现更好，是使用较多的一种；异构体 I 的 CAS 号为 3326-32-7。^[3] 异构体混合物的 CAS 号则记为 27072-45-3。^[2] 这些编号差异来自异构体组成不同，并不代表化学本质的差别。

原理

FITC 的发光来自荧光素部分的共轭芳香环体系。分子吸收特定波长的光后，电子跃迁到能量较高的激发态，随后在返回基态的过程中以光子形式释放能量，发射光波长通常长于激发光波长。^[5] 各厂家给出的数值略有出入，一般记为最大激发约 492 至 495 纳米，最大发射约 518 至 520 纳米，处于可见光的黄绿区段。^[6]

标记反应发生在异硫氰酸酯基团上。该基团在偏碱性条件下与蛋白质 N 端氨基或赖氨酸侧链的伯胺反应，生成硫脲键，从而把荧光素共价接到蛋白上；常用 pH 范围为 7.0 至 9.0，实际操作多在 pH 8.0 至 9.0 的缓冲液中进行。^[2] 由于反应依赖伯胺，缓冲液中若含 Tris、甘氨酸等含氨基试剂，会与目标蛋白竞争而抑制标记。^[7]

标记完成后需要去除游离染料，常用方法包括透析与凝胶过滤层析。^[3] 偶联效果一般用荧光素与蛋白的摩尔比（F/P）衡量，可通过 495 纳米与 280 纳米处的吸光度换算，比值过低信号弱，过高则背景增强。^[7]

发展历程

把荧光染料接到抗体上以定位抗原的思路由库恩斯（A. H. Coons）等人在 20 世纪 40 年代初实现，最初使用的是荧光素异氰酸酯而非异硫氰酸酯。^[8] 相关工作发表于 1941 年与 1942 年，最初用于在小鼠组织中定位肺炎球菌抗原。^[9]

1958 年，里格斯（Riggs）等人引入了更稳定、使用更方便的异硫氰酸酯形式，即后来通称的 FITC，此后它长期是使用最广的荧光色素之一。^[10] 早期 FITC 在强光照射下褪色较快，这一问题在此后通过改进观察与成像条件得到缓解。随着荧光显微镜、流式细胞术和激光共聚焦等仪器的普及，FITC 成为这些平台上的常规标记选择。

应用

最典型的用途是标记抗体与纯化蛋白，制成免疫荧光探针，用于荧光显微镜观察、流式细胞分析以及酶联免疫吸附、蛋白印迹等免疫学检测。^[2] 在流式细胞术中，FITC 的激发峰与氩离子激光的 488 纳米谱线接近，因而适合作为常规绿色通道染料。^[11]

除蛋白外，FITC 也可标记寡核苷酸用作杂交探针，或标记凝集素、多肽等分子。^[12] 在细胞实验里，FITC 标记的葡聚糖可用于血管通透性与示踪研究，Annexin V-FITC 则常与碘化丙啶搭配用于凋亡检测。^[3] 在医学与农业检验中，荧光抗体法可用于细菌、病毒与寄生虫所致疾病的快速诊断。^[7]

FITC 的荧光强度对所处环境敏感，可随 pH 变化而改变，也会受铜离子等影响，因此也被用于构建相应指标的传感与检测体系。^[3] 另有一类用途与其标记功能无关：FITC 可作为半抗原诱发接触性超敏反应，被用于特应性皮炎等模型的研究。^[4]

局限

FITC 的激发与发射峰较窄且固定，发射光谱与藻红蛋白等其他常用染料存在明显重叠，多色标记时需要仔细搭配通道，否则容易发生串色。^[11] 早期观察还发现，它在强照明下光稳定性有限，长时间曝光易出现信号衰减。

FITC 本身不能穿透活细胞膜，通常只用于标记活细胞表面抗原，检测胞内蛋白需先固定并透化。^[13] 其荧光量子产率虽高，但强度受 pH 影响，在酸性环境中信号会下降，定量比较时需注意缓冲条件。^[3]

标记反应对体系中的游离氨基敏感，含 Tris、甘氨酸或叠氮钠的缓冲液会干扰偶联，蛋白浓度过低时标记效率也明显下降。^[7] 此外，FITC 遇光与湿气易变质，需避光、干燥并在低温下保存，溶液宜现配现用。^[1]

参见

• 荧光素 —— FITC 的母体分子，决定其发光性质的核心骨架

• 免疫荧光 —— FITC 标记抗体最经典的应用场景

• 流式细胞术 —— 以 FITC 为常规绿色通道染料的细胞分析技术

• 异硫氰酸酯 —— FITC 用于共价连接蛋白的反应基团所属的化合物类别

• 荧光显微镜 —— 观察 FITC 标记样品的常用仪器