DNA重组技术

定义

DNA重组技术又称重组DNA技术，指按照设计，用酶学方法在体外把不同来源的DNA片段剪切、连接，组装成自然界原本不存在的重组DNA分子，再引入宿主细胞使其复制或表达的操作体系^[1]。学术界也常把它径直称为基因工程，两者在多数语境下所指相同^[2]。这一技术的关键在于重组分子必须能随宿主细胞的繁殖而扩增，从而获得目的基因的大量拷贝，而不只是一次性的体外拼接^[3]。

所用DNA可来自亲缘极远的生物，原核生物与真核生物之间、动物与植物之间的遗传信息都能经此转移，这突破了常规育种受物种界限限制的局面^[2]。

原理

重组过程一般被概括为分、切、接、转、筛五个环节：先分离纯化目的DNA与载体DNA，再用限制性内切酶分别切割二者，接着在体外把两者连接，随后把重组分子导入合适的宿主细胞，最后通过选择标记区分含插入片段的重组子与自身环化的空载体^[4]。整个过程依赖三类工具：识别特定序列并切割DNA的限制性核酸内切酶，封闭DNA骨架缺口的DNA连接酶，以及能把外源片段带进宿主并自主复制的载体^[2]。

限制酶通常识别4至8个碱基的特定序列，识别序列越短则切出的片段平均越短：识别4个碱基的酶平均产生约250碱基对的片段，识别6个碱基的约4000碱基对，识别8个碱基的约64000碱基对。切割后可产生两条链等长的平末端，或两端不等长的黏性末端；同一种酶切出的黏性末端彼此互补，因此不同来源的片段能先行退火配对，再由连接酶封口^[5]。

载体至少要具备三方面条件：在特定宿主中能独立复制的复制起点、可供插入外源片段且不破坏自身结构的多克隆位点、便于筛选检测的标记基因^[4]。常用载体包括质粒、噬菌体以及动植物病毒，其中质粒是许多细菌和酵母中位于染色体之外、可自主复制的小型环状DNA^[2]。后来发展的位点特异重组体系如Gateway技术，利用噬菌体的att位点重组反应，可省去酶切与连接步骤而直接转移目的序列^[6]。

把重组分子送入宿主后，需借标记基因完成筛选，例如外源片段插入导致质粒上某个抗性基因失活，据此可辨别重组子^[7]。含有重组质粒的宿主细胞经培养大量繁殖，目的片段随之扩增，这一步骤被称为克隆。

发展历程

技术得以成立，靠的是此前一系列基础发现：1967年前后DNA连接酶被发现，1970年限制性内切酶被首次报告，同年逆转录酶与DNA化学合成方法也相继问世^[8]。1972年，美国斯坦福大学的生物化学家保罗·伯格(Paul Berg)首次在体外把一段基因拼接至猿猴病毒SV40的DNA上，取得第一批重组DNA分子，此项工作后来为他赢得1980年诺贝尔化学奖^[9]。

1973年，斯坦福大学的斯坦利·科恩(Stanley Cohen)与赫伯特·博耶(Herbert Boyer)等以大肠杆菌质粒为载体，用同一种内切酶切取外源片段并插入质粒，导回大肠杆菌后随宿主繁殖而扩增，构建出具有生物功能的细菌质粒，被视为基因工程的首次成功实验^[10]。1977年，博耶等将化学合成的人生长激素抑制素基因与大肠杆菌质粒重组，在大肠杆菌中产出该激素^[11]。

重组实验的安全风险很快引起科学界自身警觉。1974年，一批美国分子生物学家呼吁暂停部分可能有害的重组DNA实验；1975年2月，国际重组DNA分子会议在加利福尼亚州阿西洛马召开，约140名生物学家、律师、记者与政府官员参加，会议决定研究可以继续，但须遵循严格准则。会议按风险等级设定物理防护与生物防护两重措施，其建议成为美国国立卫生研究院1976年正式发布的指南的基础，也影响了此后全球实验室生物安全分级的设计^[12]。

准则确立后研究迅速推进。1978年，人胰岛素基因在大肠杆菌中表达成功；1982年，用遗传工程菌生产的人胰岛素在英美等国获批上市，成为首个由重组DNA技术制得的药物^[13]。此后干扰素、生长激素、疫苗抗原等产品陆续通过同类路线获得^[14]。

应用

在医药领域，重组DNA技术用于生产激素、细胞因子、疫苗抗原等蛋白类药物，使人胰岛素、生长激素等原先只能从动物脏器或人源组织中提取的物质得以大量制备^[14]。结合PCR等技术，它也被用于基因诊断，并作为基因治疗与遗传病防治研究的基础手段^[1]。

在基础研究中，该技术使单个基因能够被分离、扩增和修改，从而在分子水平上解析基因结构、表达调控与蛋白功能^[14]。农业与工业方面，它被用于品种改良和微生物发酵生产，例如培育抗虫作物、改造菌种以提高目标产物产量。

教学与实验室实践中，该技术是分子生物学课程的核心内容之一，常以构建重组质粒的实验训练酶切、连接、转化与鉴定的完整流程^[6]。

局限

载体的装载能力有限，是早期克隆的明显约束：以质粒为载体一般只能容纳约1.5万碱基对以下的片段，噬菌体载体约为1.5万至2万碱基对，黏粒载体约在5万碱基对以内。因此大片段DNA必须先切成小片段才能克隆，而片段化本身会丢失基因原有的完整环境。

传统酶切连接路线依赖载体与片段上存在合适的酶切位点，若目的序列内部恰好带有该位点，就会被切断；选择位点时还需考虑两个位点末端能否互补，双酶切时缓冲液条件与酶用量也需另行调整^[6]。连接效率同样构成限制，平末端连接的效率明显低于黏性末端，往往需要额外加入RNA连接酶等方式提高^[7]。

重组分子进入宿主后能否正确表达，还受物种差异制约，原核与真核生物在基因结构与表达方式上存在基本差别，直接移植的基因未必能产生有活性的蛋白^[8]。此外，重组实验涉及生物安全与伦理问题，各国均以指南或法规对实验类别、防护等级和禁止事项作出限定，部分高风险实验不被允许开展。

参见

• 基因工程 —— 与DNA重组技术所指基本相同的技术领域，侧重按设计改造生物遗传性状。

• 限制性内切酶 —— 识别特定序列并切割DNA的工具酶，被称为分子手术刀。

• DNA连接酶 —— 封闭DNA骨架缺口、把片段接合的酶，被称为分子针线。

• 质粒 —— 染色体外可自主复制的环状DNA，是最常用的克隆载体。

• 聚合酶链式反应 —— 体外扩增DNA片段的技术，常与重组操作配合使用。

• 生物安全 —— 重组DNA实验的防护等级、准则与监管框架所指向的安全议题。