聚合酶链式反应

定义

聚合酶链式反应是一种在体外对指定核酸片段做酶促合成、并借反复热循环使其数量成倍增长的实验技术。^[2]全国科学技术名词审定委员会把它定义为：在模板 DNA、底物、上下游引物和耐热 DNA 聚合酶齐备的条件下，经多次“变性—复性—延伸”循环，痕量模板可扩增至几百万倍。^[2]它被看作生物体内 DNA 复制过程在试管中的模拟，扩增的起点与终点由一对引物的位置决定，因而产物长度是可设定的参数。^[4]

反应体系通常包含四类成分：含待扩增序列的 DNA 模板、一对短链寡核苷酸引物、耐热 DNA 聚合酶以及四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)。^[2]反应在称为热循环仪的温控设备中进行，该仪器能在变性、退火、延伸三个温度之间按程序切换。^[1]若以 RNA 为起始材料，需先用逆转录酶把它转成互补 DNA，再进行扩增，这一分支称为逆转录 PCR。^[5]

原理

每一轮循环由三个温度阶段构成。^[5]首先在约 94 摄氏度下短时加热，双链 DNA 之间的氢键断裂，解成两条单链模板；随后温度降至 55 至 65 摄氏度，引物按碱基互补配对原则结合到模板的相应位置；最后升温至约 72 摄氏度，耐热聚合酶以单链为模板、以 dNTP 为原料，沿 5′ 到 3′ 方向把核苷酸逐个接上，合成互补链。^[5]一轮结束后新链与模板一同被解开，两者都可充当下轮的模板，因此产物量按 $2^n$ 的方式累积，其中 $n$ 为循环数。^[6]

整个流程可以用下图概括：

$\text{双链模板} \xrightarrow{94\,^\circ\text{C 变性}} \text{两条单链} \xrightarrow{55\sim65\,^\circ\text{C 退火}} \text{引物结合} \xrightarrow{72\,^\circ\text{C 延伸}} \text{两条双链} \longrightarrow \text{进入下一轮}$

反应的特异性主要取决于引物与靶序列两端是否精确互补，而不是聚合酶本身。^[1]循环次数通常在 25 至 40 次之间，经过 30 轮左右，目标片段理论上可放大约 10 亿倍，因此即便样本中只有极少量模板，也能积累到可检测的水平。^[7]热循环仪因此本质上是一台精密的温控装置，升降温速率与温度均一性直接影响扩增效果。^[1]

耐热聚合酶是整个体系得以自动化的关键。取自水生栖热菌的 Taq 酶最适活性温度在 75 至 80 摄氏度附近，在 92.5 摄氏度下半衰期超过 2 小时，因此不会在每轮变性时失活。^[8]它的不足是缺少 3′ 到 5′ 外切酶校正活性，复制保真度较低，早期测得的错误率约为每 9000 个核苷酸出现 1 次错误。^[8]对保真度要求高的场合可改用带校正功能的聚合酶，例如 Pfu，但其合成速度相对较慢。^[8]

发展历程

体外扩增核酸的设想早在 1971 年就由霍拉纳等人提出，但因基因序列分析尚不成熟、耐热聚合酶未见报道、引物合成困难，长期未获实施。^[1]1976 年，钱嘉韵与埃德加、特雷拉从极端嗜热水生栖热菌中纯化出一种稳定的 DNA 聚合酶，最适温度约 80 摄氏度，即后来的 Taq 酶，为高温循环扩增提供了酶学基础。^[8]

1983 年，在美国 Cetus 公司任职的凯利·穆利斯在驾车途中形成多聚酶链式反应的构想，同年年底用同位素标记法观察到 10 个循环后的特异性片段。^[1]相关专利申请于 1985 年 10 月提交、1987 年获批，首篇学术论文于 1985 年 12 月发表；1986 年他在冷泉港实验室作专题报告后，该方法开始在全世界推广。^[1]把耐热聚合酶引入反应体系后，不必每轮补加新酶，操作大幅简化、成本下降，PCR 才真正走向常规应用。^[1]

1993 年，瑞典皇家科学院将诺贝尔化学奖的一半授予穆利斯，奖励其发明 PCR 方法，另一半授予迈克尔·史密斯。^[3]1992 年，实时荧光定量 PCR 的原理被提出，通过在反应中加入荧光基团并实时读取信号，PCR 由定性走向定量。^[9]数字 PCR 的概念在 1999 年由 Vogelstein 等人在癌症罕见突变检测中明确提出，其做法是把反应体系极限稀释后分装到大量微孔中计数。^[10]按产物检测方式划分，普通 PCR、荧光定量 PCR 与数字 PCR 常被称为三代技术，三者是互补关系而非替代关系。^[11]

应用

在感染性疾病诊断中，PCR 直接检测病原体的核酸序列，不必等待微生物培养，因而缩短了报告时间。^[3]诺奖说明中提到，该方法可用于发现 HIV 感染，也可在遗传病中定位致病的基因改变。^[3]新冠疫情期间，实时荧光定量 PCR 成为病毒核酸检测的主要手段，用于判断样本中是否存在病毒特异性基因片段。^[7]

在法医学与个体识别中，PCR 可对现场遗留的极微量生物检材做扩增，再通过短串联重复序列分型进行比对。^[7]同一原理也用于亲子鉴定与骸骨、陈旧样本的身份确认。^[12]

在基础研究与基因组学中，PCR 为测序、克隆、探针制备和突变引入提供足量模板。^[3]人类基因组计划大量依赖基于 PCR 的方法，有参与该计划的学者回顾认为，这类方法的普及对计划最终完成起到了关键作用。^[13]此外，对琥珀中昆虫、化石等古材料提取的降解 DNA 做扩增，可用于古生物学与演化关系研究。^[3]

在农业与食品领域，PCR 用于转基因成分鉴定、致病微生物检验和肉类掺假识别；在环境监测中用于水体、土壤微生物群落与病原体筛查。^[14]多重 PCR 可在同一反应中放置多对引物，同时扩增多个靶标，提高单次检测的通量。^[14]

局限

PCR 的灵敏度同时也是它最脆弱之处：极微量的扩增产物或外源 DNA 污染进入反应体系，就可能被判读为阳性，产生假阳性结果。^[2]反之，样本中的抑制物、模板降解或引物设计不当会造成扩增失败，形成假阴性，因此该技术对实验条件和质量控制要求较高。^[2]

它检测的是核酸序列而非完整的活体细胞，扩增阳性可能来自已死亡的微生物或不再具备感染性的核酸，因此不能据以判断病原体是否存活。^[15]普通 PCR 只能给出有无的定性结论，终点产物的量误差较大，无法准确定量。^[16]

荧光定量 PCR 的定量依赖阈值循环数与标准曲线，扩增效率受抑制剂和试剂批次影响，低拷贝样本的灵敏度与分辨率受限，不同厂家试剂与仪器之间的结果可比性也不理想。^[16]数字 PCR 虽可绝对定量，但动态范围较窄、设备与耗材成本高，且因只读取终点荧光，对引物特异性要求很高，非特异产物也可能被判为阳性。^[17]此外，Taq 酶缺乏校正活性带来的复制错误，使产物序列与原模板可能存在个别碱基差异，需要高保真扩增时须选用其他聚合酶。^[8]

参见

• DNA聚合酶 —— 催化引物延伸、决定扩增速度与保真度的核心酶类。

• 热循环仪 —— 按程序在三个温度间切换、完成 PCR 反应的温控设备。

• 实时荧光定量PCR —— 在反应中加入荧光标记、可实时监测并定量产物的第二代 PCR 技术。

• 数字PCR —— 把反应分割到大量微反应单元中计数、实现绝对定量的第三代 PCR 技术。

• 逆转录PCR —— 先将 RNA 逆转录为互补 DNA 再扩增，用于 RNA 病毒检测与基因表达分析。

• DNA测序 —— 与 PCR 结合使用，用于读取扩增片段碱基排列的分析技术。