微分干涉显微镜
微分干涉显微镜是借助偏振光与干涉现象,把透明或弱吸收样品内部折射率、厚度的细微差异转换为明暗反差的光学显微镜,常见形式为诺马斯基干涉相差显微镜(Nomarski DIC)。它无需染色即可观察活细胞等未标记样品,图像带浮雕式立体感且基本不出现相差显微镜的光晕伪影,因而在细胞生物学与半导体、材料表面检测中被广泛采用。
定义
微分干涉显微镜是一类以双光束剪切干涉为工作基础的光学显微镜,核心任务是把样品的光程差梯度转成可见的强度差异[1]。它与普通干涉显微镜不同:后者的两束相干光一束穿过标本、一束在标本之外,而微分干涉方式的两束光都经过标本,彼此分开的距离极小,通常只有约 1 微米量级或更小[2][3]。
在中文文献中,这一仪器常被称为微分干涉相差显微镜或干涉微分相差显微镜,英文缩写为 DIC;采用诺马斯基棱镜的普及型结构则被称为诺马斯基显微镜[4]。所得图像呈现受斜射照明般的阴影与浮雕感,反映的是样品光程的变化率,并非样品真实的三维高度[5][6]。
原理
光路通常由起偏器、聚光镜侧的双折射棱镜、物镜侧的棱镜和检偏器依次构成[7]。光源经起偏器成为线偏振光后进入沃拉斯顿棱镜或其改进型诺马斯基棱镜,被分成振动方向互相垂直、在空间上错开很小距离的两束光,该错开量称为剪切量,常见值为 0.15 至 0.6 微米,小于物镜的分辨极限[1][3]。
两束光穿过样品相邻的微小区域时,因该处厚度或折射率不同而积累不同的光程,产生相位差;随后第二个棱镜把它们重新合并,再经检偏器使振动方向一致而发生干涉,相位差由此转成亮度差别[8]。若剪切方向上光程梯度为零,则该处不产生反差,这正是微分干涉图像与样品走向有关的原因。
设剪切量为 $d$、样品在剪切方向上的光程分布为 $\delta(x)$,则两束光的程差与光程的一阶导数近似成正比:$\Delta(x)=\delta(x+d/2)-\delta(x-d/2)\approx d\,\delta'(x)$;像面强度随之线性地反映该梯度[5]。通过横向移动物镜侧棱镜,或在偏振器与棱镜之间加入四分之一波片并旋转偏振器(即 de Sénarmont 补偿),可以引入可调的偏置延迟,使背景亮度与反差达到观测需要[9][10]。
按照明方式可分为透射式与反射式两类:前者用于透明样品,需要聚光镜棱镜与物镜棱镜配对;后者只需一只诺马斯基棱镜,物镜同时充当聚光镜,系统具有自补偿特性[9]。无论哪种形式,都要求照明接近科勒照明,使通过棱镜的光近似平行,否则补偿不均匀、像面相位关系被破坏[9]。
发展历程
微分干涉成像的技术源头可追溯到 20 世纪中期。1947 年,弗朗西斯·史密斯提出用两片沃拉斯顿棱镜分离并重组剪切光束的方案,这一构思被视为微分干涉方法的起点[6][4]。不过早期装置制造困难,未能在实验室普及[4]。
1952 年,波兰物理学家乔治·诺马斯基对棱镜结构作出关键改动,把沃拉斯顿棱镜中一个石英楔的光轴方向调整,使干涉平面移到棱镜之外,从而可以将棱镜安置在物镜孔径平面附近,装置更加实用[6]。这种棱镜后来以其姓氏命名,成为商用微分干涉显微镜的标准部件。
此后技术沿着增强灵敏度与改善定量能力两个方向推进。1981 年,艾伦将摄像与图像处理同微分干涉系统结合,形成视频增强对比方式,使信噪比明显提高。20 世纪 90 年代以后,井上信也、什里巴克等人发展了剪切方向可切换的取向无关方案,通过快速改变剪切方向并配合计算,获得不受样品摆放方向影响的定量相位信息[11]。近年还出现了以超构表面替代棱镜、力图简化结构并实现单帧各向同性成像的研究[12]。
应用
生命科学是微分干涉显微镜最主要的应用领域。它对未染色、透明的活细胞与细胞器作高反差观察,能显示细胞膜、细胞核、线粒体、纤毛以及细胞分裂过程,且不因染色而损伤样品[13][7]。由于图像立体感较强,基因注入、核移植一类显微操作常在配有该装置的显微镜下完成[7]。
在工业领域,反射式微分干涉用于晶圆表面、光刻胶图形、透明薄膜台阶、划痕与污染物的检查,也用于显示面板中导电粒子压痕、金属金相组织、镀层与精密光学元件的表面质量分析[14][15]。此类检测多为非接触式,不需要对样品做腐蚀或染色等预处理[8]。
微分干涉常与荧光观察配合使用:前者提供未标记样品的形态与边界信息,后者定位特定分子标记,构成一种在活细胞研究中常见的多模态观察方式[8][13]。
局限
微分干涉图像的反差取决于光程梯度在剪切方向上的分量,若结构边界与剪切方向平行,则反差消失,因此观察结果依赖样品的摆放方向,常需转动样品或棱镜比对[11]。图像中看似立体的明暗分布只是光学效果,只对应光程梯度,并不能直接给出样品的真实高度,常规机型只能作定性观察而非定量测量[16]。
该方法依赖偏振光,样品或容器存在双折射时会破坏偏振状态并降低甚至破坏成像质量,所以塑料培养皿、塑料多孔板通常不适用于透射式微分干涉观察[6][16]。对厚度较大的样品以及染色切片,效果同样不佳[6]。
装置上,诺马斯基棱镜等偏振光学元件价格较高,且棱镜剪切量与物镜后焦面必须匹配,加工与装调误差会造成补偿不完全[17][11]。与共聚焦等技术联用时,棱镜对激发光与荧光的分束和偏振改变还会影响分辨率,限制组合方案的效果[11]。此外,当样品的光程起伏只有数纳米时,信号很弱、易被噪声淹没,观察仍然困难[18]。
参见
参考资料
- content [引用日期2026-10-29]
- 微分干涉 [引用日期2026-10-29]
- 100386-InSituCharact(PDF) [引用日期2026-10-29]
- Differential interference contrast microscopy [引用日期2026-10-29]
- with \(h\), the local thickness of the object [引用日期2026-10-29]
- Microscope à contraste interférentiel — Wikipédia [引用日期2026-10-29]
- DIC微分干涉显微镜下的世界 [引用日期2026-10-29]
- DIC 显微镜 | 微分干涉对比指南 [引用日期2026-10-29]
- reflecteddic [引用日期2026-10-29]
- fsu.edu 上的网页 [引用日期2026-10-29]
- nih.gov 上的网页 [引用日期2026-10-29]
- 基于超構表面的微分干涉相襯顯微成像方法研究 - 中國博士學位論文全文數據庫 [引用日期2026-10-29]
- 相差和微分干涉显微镜 | 定义、示例与常见问题 | JoVE Core [引用日期2026-10-29]
- 目录 [引用日期2026-10-29]
- 诺玛斯基棱镜应用领域及定制周期 [引用日期2026-10-29]
- 微分干涉相衬（DIC）显微镜：高对比度观察透明样本 [引用日期2026-10-29]
- DIC-01 [引用日期2026-10-29]
- google.com 上的网页 [引用日期2026-10-29]